Filogenómica Anvio

Preparación de archivos

Es importante que los archivos fasta cumplan las siguientes características:

• El nombre del archivo solo debe llevar caracteres alfanuméricos

• De ser necesario, solo pueden llevar guion bajo en el nombre, no puntos ni guión medio.

• La terminación del archivo debe ser .fa

• Los nombre NO deben empezar con un número

• Los nombres de las secuencias deben ser cortos, sin espacios y solo con caracteres alfanuméricos y cuando mucho guión bajo.

Set de datos

Si quieres seguir los pasos aquí descritos con el mismo set de datos, cepas de E. coli, puedes descargar el set de datos de aquí. Los genomas del set son los siguientes:

• DH10B (= K12), 1 cromosoma. CP0000948

• 0157:H7 str. TW14359, 1 cromosoma 1 plásmido. CP001368

• DH1, 1 cromosoma. CP001637

Una vez descargados de aquí, los puedes descomprimir en la carpeta en la que se vaya a trabajar y en donde solo estén ellos:

$ tar xzf ecoli.tar.gz

Análisis

Activar anvio, si aún todavía no tenemos conda en nuestro PATH:

$ source /opt/miniconda/etc/profile.d/conda.sh

Si usaremos la cuenta común en CONDA (recomendada):

$ conda activate anvio-7

NOTA. Para todos los pasos, podemos seleccionar el número de CPU a utilizar modificando el flag -T o --num-threads procurar no abusar de esta valor, 8 núcleos es suficiente.

Bases de datos

Generar una base de datos para cada genoma.

Este proceso puede durar horas y por lo tanto no sería raro que la terminal se desconectara antes de terminar, para evitar esto hay varias opciones, una buena es usar el comando de linux screen.

Primero hay que crear una nueva "sesión" con screen que la llamaremos anvio, pero puede ser cualquier nombre útil:

$ screen -S anvio

Una vez que se activa esta sesión podemos ya ejecutar el comando anterior pero teniendo cuidado de activar anvio primero, si es que no lo hicimos ya antes:

$ conda activate anvio-7

Para cada genoma, tenemos que hacer los siguientes pasos:

$ anvi-gen-contigs-database -f fastafile.fa -n PROJECT -o fastafile.db

$ anvi-run-hmms -c fastafile.db -T 4

$ anvi-run-ncbi-cogs -c fastafile.db -T 4

Si solo hemos hecho una sesión entonces no hace falta poner el nombre de la sesión, solo screen -r. Más información de screen aquí.

Listado de genomas

Al terminar el paso anterior, que puede durar horas, habrá que generar un listado de los genomas para usar con los siguientes pasos de anvio.

Generar un archivo con los nombres de los genomas y la ruta a los archivos de la base de datos a la que pertenecen

$ ls -1 *.fa > names.tmp

$ ls -1 *.db > dbs.tmp

$ paste names.tmp dbs.tmp > genome.list

$ rm *.tmp

$ sed -i 's/.fa//g' genome.list

$ sed -i '1i name\tcontigs_db_path' genome.list

El archivo de salida, genome.list, debe tener la siguiente estructura:

name contigs_db_path

CP001368_0157 CP001368_0157.db

DH10B DH10B.db

DH1 DH1.db

La primer columna (name) podemos cambiarla al nombre que deseemos, pero la segunda columna no. Para los nombres de la primer columna NO usar nombres que empiecen con número! La separación entre columnas es con tabuladores.

Single Copy Genes

Obtener los Single Copy Genes (SCG) para el análisis filogenético, checar si anvio está activado aún, si no, volver a activarlo.

$ anvi-get-sequences-for-hmm-hits --external-genomes genome.list -o concatenated-proteins.fa --hmm-source Bacteria_71 --return-best-hit --get-aa-sequences --concatenate

Árbol filogenético

Crear un árbol filogenético con los SCG

$ anvi-gen-phylogenomic-tree -f concatenated-proteins.fa -o phylogenomic-tree.txt

Pangenoma

Podemos también obtener el pangenoma:

$ anvi-gen-genomes-storage -e genome.list -o PANGENOME-GENOMES.db

$ anvi-pan-genome -g PANGENOME-GENOMES.db -n PANGENOME -T 4

Si se colaron archivos con nombre no aptos, ver arriba, aquí es donde se botará el proceso con un error. El segundo comando puede tardar bastante en completarse.

Average Nucleotide Identitity (ANI)

Hacer un análisis de ANI

$ anvi-compute-genome-similarity -e genome.list --program pyANI -o ANI -p PANGENOME/PANGENOME-PAN.db -T 4 --just-do-it

Podemos usar el programa pyANI para genomas muy cercanos, mejor resolución, o fastANI, que es más rápido pero menos sensible.

Por último podemos agregar información para que también aparezca en el pangenoma, esta información debe ir en una un archivo de texto separado por tabuladores (NO usar Word), por ejemplo:

sample year country source

DH1 1983 USA Human

DH10B 1960 USA Unknown

Ec0157 2006 USA Clinical

La primer línea debe empezar con sample y ésta columna debe tener los nombre idénticos a los archivos fasta usados al principio pero sin la extensión. Las siguientes columnas pueden ser los datos que se quiera, pero tratando de no mezclar palabras con números. Podemos nombrar a esta tabla data_for_layers.tsv por ejemplo.

El comando para incorporarla a la base de datos genera de anvio sería:

$ anvi-import-misc-data data_for_layers.tsv -p PANGENOME/PANGENOME-PAN.db --target-data-table layers